La proteasa y la b-N-acetilglucosaminidasa del patógeno de la ascosferosis Ascosphaera apis de las abejas

publication date: Oct 10, 2008
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Journal of Apicultural Research47 (1) pp. 68 - 76
fecha de publicaciónMarzo 2008
 
Titulo

La proteasa y la b-N-acetilglucosaminidasa del patógeno de la ascosferosis Ascosphaera apis de las abejas

AutoresTeerayut Theantana and Panuwan Chantawannakul
Resumen

Las enzimas líticas son conocidas normalmente por tener un papel en la entomopatogenicidad fúngica. Los patrones enzimáticos producidos por Ascosphaera apis, un patógeno que causa la ascosferosis en las larvas de abejas se determinaron mediante ensayos con el kit API ZYM y con enzimas estándar. Diez aislados de A. apis produjeron 11 enzimas (p. ej. . proteasa, β-N-acetilglucosaminidasa, fosfatasa alcalina, esterasa, esterasa lipasa, leucina arilamidasa, valina arilamidasa, fosfatasa ácida, naftol-AS-BI-fosfohidrolasa, β-glucosidasa y a-manosidasa). Las dos enzimas principales (proteasa, β-N-acetilglucosaminidasa) que deben tener un papel principal tanto en la penetración de la membrana peritrófica del intestino medio de la larva de abeja como en la rotura de la cutícula de la larva, fueron elegidas para su estudio posterior. Todos los aislados de A. apis dieron enzimas con mayor actividad proteolítica en medio de  germinación estéril después de 11 días de incubación a 30 ºC. El extracto de levadura y la glucosa fueron los componentes clave para el crecimiento fúngico y la producción de proteasa. El pH óptimo para la producción de proteasa fue 8,0. El fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) y la 1,10-fenantrolina pudieron inhibir la actividad proteasa notablemente, indicando la presencia de serina y metaloproteasas. En nuestros estudios sobre la β-N-acetilglucosaminidasa, encontramos que A. apis HL-5-2 cultivada en medio de cultivo enriquecido conteniendo 0,2% de quitina coloidal a 30 ºC durante 14 días, produjo la mayor cantidad de enzima. La purificación de β-N-acetilglucosaminidasa se llevó a cabo usando precipitación con sulfato de amonio, intercambiador iónico (DEAE-sefarosa) y cromatografía mediante columnas con gel filtrador (SephacrylS-200 HR). Después de la cromatografía de intercambio iónico, la β-N-acetilglucosaminidasa tuvo una actividad específica y una recuperación del producto del 42, y 8,4 % respectivamente. La enzima parcialmente purificada fue un monómero con un peso molecular de 5 kDa, con un pH y temperatura óptimos de 5,5 y 35 ºC. Varios compuesto catiónicos (p. ej. Ca2+, Mg2+, K+, Na+ y Li+ ) reducen ligeramente la actividad de la β-N-acetilglucosaminidasa, mientras que Cu2+ y  Zn2+ reducen significativamente su actividad un 50,31 y 91,8 % respectivamente. La enzima se mostró estable a 30-37 ºC y pH 5,0-7,0.